多肽純度是多肽總量中的百分比目標(biāo)序列。因?yàn)殡逆I的形成不是100% 有效性，并非所有肽鏈都是目標(biāo)序列。有些鏈條可能無法完成，或者氨基酸可能無法在某些鏈條上正確組合。這些刪除序列在你的混合物中形成一定比例的肽。為了實(shí)現(xiàn)所需目標(biāo)序列的純度，我們使用反相高效液相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析和凈化肽。

白色多肽粉末經(jīng)過多肽凈化和凍干后，含有一些非多肽成分，如水、吸附溶劑、計(jì)數(shù)離子和鹽。凈肽含量包括肽在最終產(chǎn)品中的實(shí)際百分比。這個(gè)數(shù)字不同，從50%到90% 不同的是，這取決于純度、合成和凈化的順序和方法。在計(jì)算生物分析或其他敏感肽實(shí)驗(yàn)中的肽溶液濃度時(shí)，必須考慮肽含量。溶劑的體積可以通過減輕非肽的重量來確定。例如，當(dāng)使用1mg成品時(shí)，產(chǎn)量為80% 的1mg/ml 當(dāng)你使用800ull液體時(shí)，你將使用800ull液體而不是1000ull液體的溶劑。

肽含量并不代表肽的純度。這是兩種測量方法。純度由高效液相色譜法測量，表明肽的存在/零污染和不希望。凈肽含量僅提供總肽百分比和總非肽成分信息，不同于多肽的出現(xiàn)。通過氨基酸分析或紫外線光度法可以準(zhǔn)確測量凈肽含量。

根據(jù)凍干肽的重量，很難確定具體的肽濃度。冷凍干肽按重量可含10-70% 水和鹽。與疏水肽相比，更親水的肽通常含有更多的水和鹽。如果肽在序列中含有發(fā)色團(tuán)，(W 或 Y 殘基) ，根據(jù)這些殘基的消光系數(shù)，可以很容易地確定肽濃度。

計(jì)算可采用以下步驟:

使用1厘米細(xì)胞在中性 pH 下280nm 處發(fā)色殘基的摩爾消光系數(shù):

色氨酸5560AU/mmol/ml

酪氨酸1200 AU/mmol/ml

氨基酸測序中每個(gè)發(fā)色團(tuán)的消光系數(shù)一般被認(rèn)為是相加的，即肽的整體摩爾消光系數(shù)取決于這些發(fā)色團(tuán)殘基在序列中的類型和數(shù)目。

計(jì)算: mg 肽/ml = (A280 x DF x MW)/e，其中 A280是溶液在1-cm 細(xì)胞中280nm 處的實(shí)際吸光度，DF 是稀釋因子，MW 是肽的分子量，e 是每個(gè)發(fā)色團(tuán)在280nm 處的摩爾消光系數(shù)。

假設(shè)的例子: 在1-cm 細(xì)胞中，具有序列 GRKKRRQRRRPPQQ (MW = 1847)的肽的50X 稀釋溶液在280nm 處讀取0.5 AU。計(jì)算儲(chǔ)備肽溶液中的原始肽濃度:

Mg 肽/ml = (0.5 AU x 50 x 1847mg/mmol)/[(1 x 5560) + (2 x 1200)] AU/mmol/ml = 5.8

注意: 任何吸光度計(jì)算都假設(shè)肽是展開的，發(fā)色團(tuán)暴露在外，通常情況下是短的可溶性肽。如果對(duì)肽的溶解度或折疊性有疑問，最好在變性條件下(例如6M GdnHCl 或8M 尿素)進(jìn)行測量。顯然，除非去除變性劑，否則這些肽溶液將變得毫無用處。

如果序列沒有色氨酸或酪氨酸，唯一可行的選擇是做氨基酸分析。

寫到最后:

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