無論是商品化蛋白或是公司內部自身開發(fā)設計的蛋白 ，在提純得到蛋白到應用以前通常必須保存第幾周至好多個月不一 。 

在此期間維持蛋白理化性質的穩(wěn)定性尤為重要 ，文中簡略介紹了造成蛋白質集聚，沉積 ，轉性等情況的要素 ，并詳細介紹了一些 保存對策來提高蛋白質的可靠性 。 

如今就帶大伙兒打開濃濃的干貨知識之行 。

蛋白質 理化性質改變的要素

蛋白質可靠性發(fā)生問題的第一個特點通常是發(fā)生沉積 ，沉淀中通常帶有非純天然的蛋白質集聚物，且這類集聚一般是不可逆的，通常不能夠修復自然的蛋白質的功能 ，除非是將集聚物融解于轉性液，如尿素溶液或鹽酸胍中，再根據(jù)復性除去轉性液使蛋白質分子再次折疊 ，修復純天然構像 。

（1）強烈 刺激性 下的蛋白質 沉積 及應對措施

多種多樣強烈的傷害可以造成蛋白沉淀 ，包含pH 值轉變 ，環(huán)境溫度轉變，融凍 ，在拌和（蛋白質暴露于氣體 -水頁面 ），過慮 （蛋白質暴露于液體 -固態(tài)頁面 ）等，以上要素均可以造成蛋白空間布局的轉變，進而產(chǎn)生沉積 。

當溶液中非純天然蛋白質集聚物充足小時 ，如二聚體，四聚體等，蛋白質可以維持可溶解情況 。 

掌握這種集聚物的成分水準十分關鍵 ，由于 與純天然 蛋白 對比 ，其構造和活力很有可能早已 發(fā)生了轉變 ，即使這種集聚物保持 在2%-3%那樣很低的水準 ，也可以拼裝形核 ，進而推動蛋白質迅速的集聚和沉積。 

這就可以表述為何某類 蛋白在比較穩(wěn)定的保存 一段時間后，忽然 產(chǎn)生很多沉積，可溶集聚 物在做到開啟能量源轉化成的閥值水準以前沉積不容易 產(chǎn)生 ，將帶有可溶集聚物的蛋白質暴露于強烈的條件中，如拌和或過慮 ，可以更快的推動能量源的生成和沉積 。

（2）氨基酸主鏈發(fā)生變化造成蛋白質沉積及應對措施

除開 強烈刺激性 ，氨基酸主鏈發(fā)生變化也是蛋白沉淀的主要要素 ，如有氧化和水解反應到時候導致蛋白作用 改變 。

酶促反應結構域 處的甲硫氨酸殘基的氧化會造成蛋白質失活，在甲硫氨酸和胱胺酸 殘基及其帶有芳香族主鏈的氨基酸 （谷氨酸 ，組氨酸和酪氨酸 ）最易于產(chǎn)生化學作用 ，分子結構氧的存有 ，賦形劑及其 器皿中還原性污染物質都能夠引物設計化學作用 ，比如帶有氧化還原反應活力的金屬離子，瓶蓋中帶有殘余的原子團殘渣等均可造成化學作用 ，一般添加一些增稠劑 ，如綿白糖 ，對純天然情況夯實 ，可以減緩暴露殘廢的氧化率。

水解作用既可以出現(xiàn)在氨基酸的主鏈 （像天冬酰胺和谷氨酰胺殘基 產(chǎn)生的脫氟苯 功效）還可以產(chǎn)生在肽碳鏈 上，造成肽官能團的激光切割 ，天冬酰胺殘基的脫氟苯功效高寬比在于相鄰的殘基 ，若下一個氨基酸是甘氨酸 ，其溶解的速率更快 。 

多肽鏈部分的軟性可以危害脫氟苯 功效 ，大部分主要的外界因素 如pH 值，緩沖溶液類型可以加快這些反映 ，在堿性 pH 和濃度較高的的緩沖溶液中，反應速率尤其快。

蛋白質普遍的多種保存方法

（1）在液體狀態(tài)下不凍結保存

蛋白質一般在2-8℃開展 短期內保存 ，這對保持蛋白的可靠性尤其合理 ，殊不知蛋白質即使不產(chǎn)生集聚沉積 ，也會產(chǎn)生遲緩的化學降解過程 ，蛋白質在溶液情況下的集聚水平最少 ，大部分蛋白質平穩(wěn)的pH范疇較小，在這里范疇以外，蛋白質去折疊的工作能力加強。 

非特異性增稠劑 ，如綿白糖 ，在其濃度做到 0.5 M時，對保持 蛋白質的可靠性具備不錯的實際效果 。 很多添加物，如硫酸銨，甘氨酸 ，聚乙二醇 ，綿白糖 等，可以根據(jù)優(yōu)先選擇 排阻 （PreferentialExclusion）的方式保持 蛋白質 的熱學 可靠性 ，在其中檸檬酸鈉鹽緩沖溶液實際效果最好 。

此外 一種保持蛋白質可靠性不錯的辦法 是減少蛋白質的濃度 ，較低濃度的可以減少蛋白質的集聚率，這類速率對蛋白質的濃度十分比較敏感 ， 殊不知 ，蛋白質的濃度也不能過低，如小于0.1 mg /ml ，過較低濃度的的蛋白會導致非特異性的吸咐到器皿的內壁 ，進而導致損害 。

除此之外 ，蛋白質緩沖溶液的含鹽量針對保持蛋白質 溶液的可靠性十分關鍵 ，如PBS緩沖溶液中，NaCl的濃度通常保持在150 mM ，這是由于溶液中正離子的電荷屏蔽掉減少了蛋白質分子間的電荷 -電荷 排斥功效 ，這種離子濃度的選擇必須實際的實驗提升 

（2）在凍結環(huán)境溫度下保存

冷藏保存是蛋白質存儲的基本方式 。 

在低溫情況下，蛋白質溶解的速度減少 ，在超低溫不造成蛋白質產(chǎn)生轉性時，試品可以平穩(wěn)保存好多個 月，在-80 ℃甚至于 更低的環(huán)境溫度 下，蛋白 的保存時間更久。

殊不知，冷藏也會造成很多蛋白的轉性，這種要素包含超低溫 ，物質的量濃度的濃度 ，冰-液體頁面的產(chǎn)生 ，pH 值的強烈 波動 等。 

凍存蛋白最易犯的不正確是應用磷酸鹽緩沖液 ，超低溫下的堿性鹽結晶體 ，而酸堿性鹽依然可溶解 ，那樣倍他米松 的pH值降低許多 ，如pH4，這會導致 很多蛋白產(chǎn)生轉性 ，在冷藏期內 pH 不太發(fā)生變化的緩沖溶液有檸檬酸鈉鹽，Tris，組氨酸等。

在蛋白質溶液中添加保護劑可以合理減少蛋白轉性 和沉積 ，這種方式 包含 ：添加凡士林 ，鹽析鹽和二糖，通常濃度高過 0.3 M，可具有不錯的功效，添加表活劑 ，其能與蛋白質分子競爭冰-液體頁面 來抑止 蛋白質變性，通常濃度 低至0.1 %，就能 得到有效的實際效果  ，添加 BSA 或高聚物 也可以抑止冷藏造成的蛋白質去折疊 ，一般添加占比為百分之幾十 。 

根據(jù) 提升蛋白質的起止濃度 ，可以提高在融凍過程中蛋白質制取物對損害的耐受力 ， 當蛋白質的起止濃度提高時，轉性蛋白質分子的百分數(shù)也會降低 。針對 -80 ℃和-20 ℃保存 ，優(yōu)選 -80 ℃。 

一方面超低溫可以比較大水平減少蛋白溶解速度 ；另一方面因為 -20 ℃電冰箱常常電源開關的特性 ，環(huán)境溫度一般 達不上 -20℃，尤其是靠門的地區(qū) ，特別是無霜冰箱中還會繼續(xù)發(fā)生不斷融凍的狀況 。 

并且，-20 ℃貼近 一些 鹽的共融點，在這個環(huán)境溫度左右易導致結晶的不斷融凍 ，造成蛋白質變性。 

最終必須指出的是，蛋白要避免重復融凍 ，散裝凍存 ，每回融化 一支 ，隨后應用 。

（3）凍干 保存

凍干是將溶劑或懸浮物質在較低溫度下冷藏 ，隨后將其由固態(tài)立即提升為氣體的一種干燥方式 ，

該方式可以非常好地維持成分骨架的可靠性 ，而且在復融后都不 改變 。

凍干 一般 包含三個過程 ：預凍結，提升干燥 (或稱第一階段干燥 )，分析干燥 (或稱第二階段干燥 )，雖然凍干可以比較好 的保持蛋白的可靠性 ，可是 在凍干過程中加上必需的增稠劑以防止蛋白質的轉性至關重要 ，這在其中并以還原型的海藻糖和綿白糖對蛋白質的維護最有效。 

凍干過程要避免應用還原型糖，如葡萄糖水，麥牙糖，乳清蛋白等，其會造成美拉德（Maillard）反映溶解蛋白質 ，在冷藏期內 ，維護水平在于起止的總糖 濃度 ；在干燥期內 ，維護功效在于糖與蛋白質的質量比。 

冷藏維護是因為從蛋白質表面的優(yōu)先選擇排阻 ，那樣便提升了去折疊的活化能 ，在干燥期內 ，伴隨著與蛋白質分子表面 產(chǎn)生水合作用的水被除去 ，蛋白質分子去折疊 ，糖可以 利用在凍干蛋白質的缺水部位融合氫氧根離子來防止這類毀壞 。

因為凍干加工工藝繁雜 ，設備價格昂貴，耗能比較大 ，這也是一般實驗室承受不住的，通常做為蛋白保存的最終選擇 。 

針對凍干初學者而言 ，設定下列狀態(tài)變量會降低探索時間 ：制取蛋白的原始濃度相對性高些，可以提升對冷藏的耐受力 ，并降低要干燥的容積 ；應用充足的海藻糖或綿白糖來抑止在冷藏和干燥中的蛋白去折疊。 

假如蛋白質制劑可以承受冷藏 ，糖與蛋白質的質量比例在1-2中間 ，通常可以合理的防止在干燥過程中蛋白質的去折疊 。 在冷藏 期內 ，假如必須 維護 ，糖的起止濃度通常必須做到200 -300mM才可以達到最好維護 ，最終，必須明確的是蛋白質保存樣本中，盡量不能帶有蛋白酶，蛋白酶的催化具備精確性 ，催化高效率遠遠地高過有機物催化劑 。 

寫到最后：

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