3-胰細(xì)膚水樣胰蛋白酶(3C-likeProteinase，3CLPro)是新式新冠病毒的關(guān)鍵的胰蛋白酶，另外也是病毒感染非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp5。3CLPro能夠 水解反應(yīng)病毒感染活性多肽為多功能性蛋白質(zhì)，針對(duì)病毒性感染與拷貝有關(guān)鍵功效，是開發(fā)設(shè)計(jì)抑止抗病毒的藥的關(guān)鍵靶標(biāo)。

      高品質(zhì)的3CLPro蛋白質(zhì)是目的性藥物研發(fā)和評(píng)定的重要。下列是3CLPro酶活檢驗(yàn)方式，15min進(jìn)行檢驗(yàn)，可用以3CLPro以及緩聚劑的評(píng)定。

3CLPro

技術(shù)指標(biāo)：

      檢驗(yàn)基本原理：

      熒光基團(tuán)EDANS和猝滅官能團(tuán)DABCYL均被聯(lián)接到3CLPro胰蛋白酶的純天然底物上，當(dāng)該底物未被斷開時(shí)，DABCYL可猝滅EDANS瑩光，進(jìn)而檢驗(yàn)不上瑩光；當(dāng)該底物被3CLPro胰蛋白酶斷開時(shí)，EDANS瑩光已不被DABCYL猝滅，隨后可檢驗(yàn)到EDANS瑩光。胰蛋白酶緩聚劑的實(shí)效性也可憑著EDANS瑩光抗壓強(qiáng)度的轉(zhuǎn)變開展檢測(cè)。

      檢驗(yàn)方式

      提前準(zhǔn)備原材料：

Assaybuffer：50mMTris-HCl,pH7.0

2019-nCoV3C-likeProteinase（3CLPro，NovoproteinCat#CR76）

3MMDabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans

      檢驗(yàn)流程：

1.配置90μl反映管理體系：50mMTris-HCl,60μMDabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans，pH7.0，37℃孵育5min；

2.添加酶液10μl，攪拌，用340nm光波長(zhǎng)激起，535nm光波長(zhǎng)測(cè)量10min內(nèi)吸光度值的轉(zhuǎn)變，每一分鐘載入一次標(biāo)值，測(cè)算每分OD值轉(zhuǎn)變值ΔODtest（以10μlAssaybuffer替代酶液設(shè)成空白試驗(yàn)，記為ΔODblank）。

3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

4. 計(jì)算3CLPro的比活（pmol/min/mg）

Vs：樣品體積 (0.01ml)

Df：稀釋倍數(shù)

2.204092：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率

C：酶濃度 (mg/ml)

新冠相關(guān)產(chǎn)品：

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