多肽是由多個(gè)氨基酸經(jīng)過肽鍵銜接而構(gòu)成的一類化合物，普遍存在于生物體內(nèi)，迄今在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多肽已達(dá)數(shù)萬種。多肽在調(diào)理機(jī)體各系統(tǒng)、器官、組織和細(xì)胞的功用活動(dòng)以及在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并且常被應(yīng)用于功用剖析、抗體研討、藥物研發(fā)等范疇。隨著生物技術(shù)與多肽合成技術(shù)的日臻成熟，越來越多的多肽藥物被開發(fā)并應(yīng)用于臨床。

多肽修飾品種繁多，能夠簡(jiǎn)單劃分為后修飾和過程修飾（應(yīng)用衍生化的氨基酸修飾），從修飾位點(diǎn)不同則可分為N端修飾、C端修飾、側(cè)鏈修飾、氨基酸修飾、骨架修飾等（圖1）。作為一種改動(dòng)肽鏈主鏈構(gòu)造或側(cè)鏈基團(tuán)的重要手腕，多肽修飾可有效改動(dòng)肽類化合物的理化性質(zhì)、增加水溶性、延長體內(nèi)作用時(shí)間、改動(dòng)其生物散布情況、消弭免疫原性、降低毒反作用等。本文主要引見幾種最主要的多肽修飾戰(zhàn)略及特性。

1、環(huán)化

環(huán)肽在生物醫(yī)學(xué)中具有諸多應(yīng)用，而且許多具有生物活性的自然多肽都是環(huán)狀多肽。由于環(huán)肽常常比線性肽更具有剛性，因而它們抵消化系統(tǒng)具有極強(qiáng)的抵御力，能夠在消化道中存活，并且對(duì)靶受體表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力。環(huán)化是合成環(huán)狀多肽最直接的途徑，特別關(guān)于構(gòu)造骨架較大的多肽。依據(jù)環(huán)化方式能夠分為側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)健⒔K端-側(cè)鏈?zhǔn)?、終端-終端式（頭尾相連式）。

（1）側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)剑?/span>sidechain-to-sidechain）

側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化最常見類型是半胱氨酸殘基間的二硫橋接，引入這種環(huán)化的辦法是經(jīng)過一對(duì)半胱氨酸殘基脫維護(hù)然后氧化構(gòu)成二硫鍵。經(jīng)過選擇性地移除巰基維護(hù)基能夠完成多環(huán)的合成。環(huán)化既能夠在解離后的溶劑里完成，也能夠在解離前的樹脂上完成。由于樹脂上的多肽不易構(gòu)成可環(huán)化的構(gòu)象，因而在樹脂上環(huán)化可能要比在溶劑中環(huán)化低效。側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化的另一品種型是在門冬氨酸或谷氨酸殘基與根底氨基酸之間構(gòu)成酰胺構(gòu)造，它請(qǐng)求多肽無論是在樹脂上還是解離后，側(cè)鏈維護(hù)基都必需可以選擇性移除。第三種側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化是經(jīng)過酪氨酸或?qū)αu基苯甘氨酸構(gòu)成聯(lián)苯醚。自然產(chǎn)物中這品種型的環(huán)化只在微生物產(chǎn)物中存在，而且環(huán)化產(chǎn)物常常具有潛在藥物價(jià)值。制備這些化合物需求共同的反響條件，因而不常用于常規(guī)多肽的合成。

（2）終端-側(cè)鏈?zhǔn)剑?/span>terminal-to-sidechain）

終端-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化通常觸及C末端與賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈的氨基，或者N末端與門冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈。還有一些多肽環(huán)化是經(jīng)過末端C與絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈構(gòu)成醚鍵而構(gòu)成。

（3）終端-終端式或頭尾相連式（head-to-tail）

鏈狀多肽能夠在溶劑中環(huán)化或者固定在樹脂上經(jīng)過側(cè)鏈環(huán)化。在溶劑中環(huán)化應(yīng)該用低濃度的多肽以防止多肽的低聚反響。頭尾相連式合成環(huán)狀多肽的產(chǎn)率取決于鏈狀多肽的序列。因而，在大范圍制備環(huán)狀多肽前，首先應(yīng)該創(chuàng)立可能的鏈狀先導(dǎo)多肽庫，然后停止環(huán)化以尋覓能到達(dá)最佳結(jié)果的序列。

2、N-甲基化

N-甲基化最初呈現(xiàn)在自然多肽中，并被引入到多肽合成中以阻止氫鍵的構(gòu)成，進(jìn)而使得多肽愈加耐受生物降解和肅清。應(yīng)用N-甲基化的氨基酸衍生物合成多肽是最主要的辦法，另外也可應(yīng)用N-(2-硝基苯磺酰氯)多肽-樹脂中間體與甲醇停止Mitsunobu反響，該辦法已被用于制備含有N-甲基化氨基酸的環(huán)狀多肽庫。

3、磷酸化

磷酸化是自然界中最常見的翻譯后修飾之一。在人類細(xì)胞中，超越30％的蛋白質(zhì)被磷酸化。磷酸化，特別是可逆磷酸化，在控制許多細(xì)胞過程中起重要作用，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架調(diào)理以及細(xì)胞凋亡。

磷酸化能夠在各種氨基酸殘基上察看到，但最常見的磷酸化目的是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸衍生物既可在合成中引入到多肽也可在多肽合成以后構(gòu)成。運(yùn)用可選擇性移除維護(hù)基團(tuán)的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基能夠完成選擇性磷酸化。一些磷?；噭┮部山?jīng)過后修飾在多肽中引入磷酸基團(tuán)。近年來，有學(xué)者運(yùn)用化學(xué)選擇性的Staudinger-亞磷酸酯反響完成了賴氨酸的位點(diǎn)特異性磷酸化（圖3）

4、豆蔻?；妥貦磅；?/span>

用脂肪酸?；?/span>N末端能夠讓多肽或蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜分離。N末端上豆蔻酰化的序列能夠使Src家族的蛋白激酶和逆轉(zhuǎn)錄酶Gaq蛋白靶向分離細(xì)胞膜。應(yīng)用規(guī)范的偶聯(lián)反響即可將豆蔻酸銜接到樹脂-多肽的N末端，生成的脂肽可在規(guī)范條件下解離并經(jīng)過RP-HPLC純化。

5、糖基化

糖肽類如萬古霉素和替考拉寧是治療耐藥細(xì)菌感染的重要抗生素，其他糖肽常被用于刺激免疫系統(tǒng)。另外，由于很多微生物抗原是糖基化的，因而研討糖肽對(duì)進(jìn)步感染的治療效果具有重要意義。另一方面，有研討發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出異常的糖基化，這使得糖肽在癌癥和腫瘤免疫防御研討中也發(fā)揮著重要作用。糖肽的制備普通應(yīng)用Fmoc/t-Bu辦法。糖基化殘基，比方蘇氨酸和絲氨酸常經(jīng)過五氟苯酚酯活化的Fmoc維護(hù)糖基化氨基酸引入到多肽中。

6、異戊二烯化

異戊二烯化發(fā)作在C末端左近側(cè)鏈上的半胱氨酸殘基。蛋白質(zhì)的異戊二烯化能夠進(jìn)步細(xì)胞膜親和性，構(gòu)成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用。異戊二烯化的蛋白質(zhì)包括酪氨酸磷酸酶、小GTP酶、協(xié)同伴侶分子、核纖層和著絲粒分離蛋白。異戊二烯化的多肽能夠應(yīng)用樹脂上的異戊二烯化辦法或者引入半胱氨酸衍生物制備。

7、聚乙二醇（PEG）修飾

PEG修飾可用于改善蛋白水解穩(wěn)定性、生物散布和肽的溶解度。在多肽上引入PEG鏈能夠改善它們的藥理性質(zhì)，也能夠抑止多肽被蛋白水解酶水解。PEG多肽比普通多肽更容易經(jīng)過腎小球毛細(xì)血管截面，大大減少腎肅清率。由于PEG多肽在體內(nèi)的有效半衰期延長，因而運(yùn)用更低劑量、更低頻度的多肽藥物便能夠維持正常治療程度。但PEG修飾也存在負(fù)效應(yīng)。大量PEG在阻止酶降解多肽的同時(shí)也會(huì)減少多肽與目的受體的分離。但PEG多肽的低親和力通常被其更長的藥動(dòng)學(xué)半衰期抵消，經(jīng)過在體內(nèi)存在更久，PEG多肽有更大可能性被目的組織吸收。因而，PEG聚合物的規(guī)格應(yīng)該針對(duì)最佳結(jié)果停止最優(yōu)化設(shè)計(jì)。另一方面，由于腎肅清率降低，PEG多肽會(huì)在肝臟累積形成大分子綜合征。因而，當(dāng)多肽用于藥物測(cè)試時(shí)需求愈加慎重地設(shè)計(jì)PEG修飾。

PEG修飾劑常見的修飾基團(tuán)大致可總結(jié)如下：氨基（-Amine）-NH2，氨甲基-CH2-NH2，羥基-OH，羧基-COOH，巰基（-Thiol）-SH，馬來酰亞胺-MAL，琥珀酰亞胺碳酸酯-SC，琥珀酰亞胺乙酸酯-SCM，琥珀酰亞胺丙酸酯-SPA，N-羥基琥珀酰亞胺-NHS，丙酸基-CH2CH2COOH，醛基-CHO（如丙醛-ALD，丁醛-butyrALD），丙烯酸基（-Acrylate）-ACRL，疊氮基-Azide，生物素基-Biotin，熒光素基-Fluorescein，戊二酸基-GA，酰肼基-Hydrazide，炔基-Alkyne，對(duì)甲苯磺酸酯基-OTs，琥珀酰亞胺琥珀酸酯-SS等。帶有羧酸的PEG衍生物能夠與N末端的胺或者賴氨酸側(cè)鏈停止偶聯(lián)。氨基活化的PEG能夠與門冬氨酸或者谷氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)。MAL活化的PEG能夠與完整脫維護(hù)的半胱氨酸側(cè)鏈的硫醇停止偶聯(lián)[11]。PEG修飾劑常見分類如下（注：mPEG即methoxy-PEG，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH）：

（1）直鏈PEG修飾劑

mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS

（2）雙官能團(tuán)PEG修飾劑

HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS

（3）分枝形PEG修飾劑

(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL

8、生物素化

生物素能夠與親和素或者鏈霉親和素有力分離，分離強(qiáng)度以至接近共價(jià)鍵。生物素標(biāo)志的肽通常用于免疫測(cè)定，組織細(xì)胞化學(xué)和基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)。標(biāo)志的抗生物素抗體也能夠用來分離生物素化多肽。生物素標(biāo)志常銜接在賴氨酸側(cè)鏈或者N末端。通常在多肽和生物素之間運(yùn)用6-氨基己酸作為紐帶，紐帶可以靈敏分離底物，并且在有空間位阻的狀況下能分離地更好。

9、熒光標(biāo)志

熒光標(biāo)志可用于追蹤活細(xì)胞內(nèi)多肽，也可用于研討酶和作用機(jī)制。色氨酸（Trp）帶有熒光，因而能夠被用于內(nèi)在標(biāo)志。色氨酸的發(fā)射光譜取決于外圍環(huán)境，隨著溶劑極性降低而降低，這種性質(zhì)關(guān)于檢測(cè)多肽構(gòu)造和受體分離很有用途。色氨酸熒光能夠被質(zhì)子化的門冬氨酸和谷氨酸淬滅，這可能會(huì)限制其運(yùn)用。丹磺酰氯基團(tuán)（Dansyl）與氨基分離時(shí)具有高度熒光，也常被用于氨基酸或蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)志。

熒光共振能量轉(zhuǎn)換（FRET）對(duì)酶的研討非常有用，應(yīng)用FRET時(shí)，底物多肽常含有一個(gè)熒光標(biāo)志基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。標(biāo)志的熒光基團(tuán)會(huì)被淬滅劑經(jīng)過非光子能量傳送淬滅。當(dāng)多肽從所研討的酶上解離下來，標(biāo)志基團(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光。

10、籠形多肽

籠形多肽有光學(xué)移除性的維護(hù)基，光學(xué)移除性維護(hù)基能夠屏蔽多肽與受體的分離。當(dāng)遭到UV映照時(shí)，多肽會(huì)被活化，恢復(fù)與受體的親和力。由于這種光學(xué)活化能夠依據(jù)時(shí)間、振幅或者位置來控制，因此籠形多肽能夠被用于研討細(xì)胞內(nèi)發(fā)作的反響。最常用于籠形多肽的維護(hù)基是2-硝基芐基及其衍生物，它們可在多肽合成中經(jīng)過維護(hù)的氨基酸衍生物而引入。曾經(jīng)開展的氨基酸衍生物有賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸。而門冬氨酸和谷氨酸衍生物由于在多肽合成和解離過程中很容易環(huán)化，因而并不常用。

11、多聚抗原肽（MAP）

短肽通常不具有免疫性，必需和載體蛋白耦合才干產(chǎn)生抗體。多聚抗原肽（MAP）由多個(gè)銜接到賴氨酸核的相同多肽構(gòu)成，能特異性表達(dá)高效免疫原，可用來制備肽-載體蛋白耦聯(lián)體。MAP多肽能夠在MAP樹脂上應(yīng)用固相合成法分步合成。但是，不完好的耦合會(huì)在一些分支上產(chǎn)生丟失或截?cái)嚯逆湥虼吮憩F(xiàn)不出本來MAP多肽的性質(zhì)。作為替代性的辦法，多肽能夠單獨(dú)制備和純化然后再耦聯(lián)到MAP上。銜接到多肽中心上的多肽序列是明白的，并且很容易經(jīng)過質(zhì)譜表征。

結(jié)語：

多肽修飾是一種設(shè)計(jì)多肽的重要手腕，經(jīng)過化學(xué)修飾的多肽不只能夠維持較高的生物活性, 而且可以有效地防止免疫原性和毒性方面的缺陷，同時(shí)化學(xué)修飾能夠賦予多肽一些新的優(yōu)秀性能。近年來，應(yīng)用C-H活化的手腕對(duì)多肽停止后期修飾的辦法也得到了迅猛的開展，并獲得了許多重要成果。

原創(chuàng)文章如有轉(zhuǎn)載，請(qǐng)注明出處“本文首發(fā)于固拓多肽合成生物科技有限公司（a7l3l.online）”