1、多肽合成

依照多肽合成常規(guī)操作合成多肽，HPLC檢測(cè)純度為95%。多肽C端增加的半胱氨酸殘基用于以其巰基銜接于偶聯(lián)劑上。

2、合成多肽與載體的偶聯(lián)

載體蛋白選擇 BSA/KLH（這里以BSA為例），用 SPDP銜接法將合成的多肽與 BSA 停止偶聯(lián)：4.6mg SPDP 溶解于 740ul DMSO，終濃度為 20mM。0.1008g BSA 溶解于 2ml PBS-EDTA 溶液中，室溫靜置1h。運(yùn)用脫鹽柱洗脫多余的 SPDP。4mg 多肽參加偶聯(lián)好的 BSA-SPDP 體系中室溫過(guò)夜。

3、多抗的制備

選體重 1. 5～2 kg 的安康雄性新西蘭大白兔， 按常規(guī)操作卡介苗活化其免疫系統(tǒng)。 將偶聯(lián)的 BSA多肽過(guò)濾除菌，100mg（2ml）加等體積的不完整佐劑，充沛混懸。在新西蘭大白兔背部多點(diǎn)皮下注射，4 周后增強(qiáng)免疫，其后每隔 2 周停止 1 次增強(qiáng)免疫，注射途徑與初次免疫相同，共兩次后，檢測(cè)效價(jià)。耳源靜脈采血、別離血清。

4、多抗的純化

Protein G 柱別離純化 IgG 抗體：PBS pH7.4 均衡 Protein G 親和柱，以 0.1M Gly-HCl pH3.0洗脫， PBS pH7.4透析，分裝，-20℃保管。

抗原親和純化：1mM 預(yù)冷的 HCl 充沛收縮 Sepharose 4FF后，15個(gè)體積的 1mM HCl清洗去殘留的蔗糖，每次清洗 2min。偶聯(lián)緩沖液 0.1M NaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl 均衡2次。多肽溶于偶聯(lián)緩沖液，調(diào)理pH值到pH8.3后，參加凝膠，室溫混旋 3h。參加1M預(yù)冷的乙醇胺混旋2h阻斷未偶聯(lián)上的活化位點(diǎn)。 50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液與 50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。PBS緩沖液均衡10 倍體積。裝柱，均衡，上樣后以 0.1M Gly-HCl pH2.2 洗脫，PBS 透析，分裝，-20℃凍存。

5、抗體效價(jià)的檢測(cè)

抗體效價(jià)的檢測(cè)有ELISA辦法或免疫雙擴(kuò)散法，這里以免疫雙擴(kuò)散法為例。

在制備的瓊脂板上按 7 孔一組的梅花形打孔（中間1孔，四周6孔）孔徑約 5mm，孔距 2mm~5mm， 汲取多肽抗原懸液滴入中間孔，等倍稀釋的血清分別參加外周的對(duì)稱孔中。37℃溫箱中作用，于 24h 后察看結(jié)果。 以呈現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的瓊擴(kuò)效價(jià)。

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